Pour tenter une réconciliation générale entre protestants et catholiques, Jeanne d’Albret et Catherine de Médicis décidèrent en 1572 le mariage d’Henri avec Marguerite de Valois (la Reine Margot). À l’occasion des noces royales, profitant de la présence à Paris d’un grand nombre de nobles protestants, les catholiques tentèrent de décapiter le parti réformé. Le 22 août, un attentat fut dirigé contre l’amiral de Coligny, qui en réchappa, mais, dans la nuit du 23 au 24 août 1572, jour de la Saint-Barthélemy, les gardes du roi Charles IX assassinèrent l’amiral, tandis que les compagnies de la milice tuaient près de trois mille personnes. Henri de Navarre n’échappa au massacre, qui se déroula jusque dans le palais du Louvre, qu’en abjurant, devant Charles IX, la religion réformée.

Le Navarrais représentait alors une menace pour le parti catholique groupé autour des Guise et de Catherine de Médicis, qui cherchaient à réduire les protestants à l’impuissance. Leur inquiétude venait du fait que les fils d’Henri II n’avaient pas d’héritiers mâles légitimes et que le Navarrais était l’héritier présomptif du trône, descendant direct du sixième fils de Saint Louis, Robert de Clermont. En vertu de la loi salique, Henri de Navarre était le plus proche parent du roi par ordre de primogéniture, bien que n’étant son parent qu’au vingt-deuxième degré.

A la mort de Charles IX, Henri III monta sur le trône après une courte régence de leur mère, Catherine de Médicis. Henri de Navarre s’enfuit de Paris où il était retenu en otage pour se faire reconnaître chef du parti réformé, solidement retranché dans ses bastions, du Poitou au Languedoc. La Paix de Beaulieu signée alors, indemnisait les victimes de la Saint-Barthélemy, accordait la liberté de culte, et octroyait des garanties militaires et juridiques aux protestants. Mais la situation politique du royaume restait trouble ; les catholiques commençaient à s’organiser en ligues. Henri de Navarre de son côté, continuait sa politique d’indépendance vis à vis du pouvoir royal. Il signat toutefois à Nérac, le 3 février 1579, un traité qui confirmait l’édit de Poitiers et octroyait aux protestants quinze places de sûreté pour six mois.

Mais la septième guerre de Religion s’annonçait. Lors de cette guerre, Henri de Navarre se fit reconnaître comme un chef de guerre capable en enlevant Cahors au terme d’un court siège (28-31 mai 1580). La prise d’armes s’acheva par la paix de Fleix (26 novembre 1580), par laquelle le Béarnais acceptait de rendre Cahors et La Fère en échange du renvoi du maréchal de Biron, trop hostile aux réformés.

Henri III, s’allia alors aux Guise contre les protestants par le traité de Nemours (7 juillet 1585). Les premières opérations militaires de la «guerre des trois Henri» furent nettement défavorables au Navarrais. Conscient de la faiblesse des forces protestantes, il fit appel aux Allemands  et aux Anglais d’Élisabeth Ire. Il accepta de rencontrer Catherine de Médicis à Saint-Brice, le 13 décembre 1586 ; l’entrevue, cependant, ne donna aucun résultat. Les forces royales, supérieures en nombre mais mal commandées, furent malmenées par les protestants, qui, sous la direction d’Henri de Navarre, furent vainqueurs à Coutras (20 octobre 1587).

Alors que Paris tombaient dans les mains des ligueurs, l’assassinat des Guise à Blois (23 et 24 décembre 1588) constitua un événement politique majeur : Henri III basculait du côté d’Henri de Navarre, en lequel il avait toujours souhaité voir son successeur, à la condition que ce dernier se convertît au catholicisme. Les troupes protestantes se joignirent alors aux soldats du roi, et marchèrent de concert sur Paris tenue alors par la Ligue.